Ocena toksycznego działania nanocząstek metali i tlenków metali metodami in vitro w celu profilaktyki zagrożeń

Celem projektu była ocena toksycznego działania nanocząstek wybranych metali i tlenków metali metodami in vitrooraz opracowanie zaleceń do oceny i ograniczania ryzyka zawodowego związanego z narażeniem na nanometale (lub ich nanotlenki).

      W ramach realizacji projektu wytyczono i zrealizowano następujące cele szczegółowe:

‒     przeprowadzono ocenę cytotoksycznego działania nanocząstek srebra oraz tlenków cynku w zależności od wielkości cząstek, oceniono biodostępność tlenków cynku na poziomie komórkowym w zależności od wielkości cząstek, zbadano zaburzenia metabolizmu tlenowego pod wpływem narażenia komórek na nanocząstki srebra i tlenku cynku oraz oceniono wpływ nanocząstek srebra i tlenków cynku na poziom uszkodzeń materiału genetycznego (DNA) w komórkach

‒     opracowano broszurę informacyjną nt. zagrożeń wynikających z toksycznego działania nanocząstek metali/tlenków metali; przygotowano materiały szkoleniowe, wraz z prezentacją multimedialną, dotyczące oceny i ograniczania ryzyka zawodowego dla pracujących w narażeniu na nanocząstki metali lub ich tlenków, opracowano zalecenia do oceny
i ograniczania ryzyka zawodowego dla osób pracujących w narażeniu na nanocząstki metali/tlenków metali do upowszechnienia w serwisie internetowym CIOP-PIB oraz przeprowadzono seminarium weryfikujące opracowane materiały

‒     przygotowano publikacje upowszechniające wyniki realizacji projektu.

Oceniono cytotoksyczne działanie: metalicznego srebra (Ag) o wielkości cząstek poniżej 10 nm, 40 nm lub 100 nm w komercyjnie stabilizowanych zawiesinach oraz pyłu srebra poniżej 150 nm, pyłów tlenku cynku (ZnO) o wielkości cząstek poniżej 50 nm i 100 nm oraz powyżej 1000 nm, a także tlenku cynku o wielkości cząstek poniżej 100 nm w zawiesinie stabilizowanej przez producenta.

Badania wykonano na komórkach raka płuc człowieka (A549), mysich makrofagach płucnych (RAW264.7) oraz na komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) i komórkach zrębowych kanalików nasiennych myszy (komórkach Sertoliego, 15P-1).

Nanocząstki scharakteryzowano pod kątem wielkości i rozkładu wielkości metodą dynamicznego rozpraszania światła (metoda DLS) oraz za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (metoda NTA). Wykonano analizę morfologiczną pyłów Ag i ZnO za pomocą skaningowego obrazowania mikroskopowego (SEM). Biodostępność nanocząstek ZnO określono na podstawie analizy PIXE (ang. proton induced X-ray emission).

Badano wpływ nanocząstek Ag oraz ZnO na integralność błon komórkowych (test NRU) oraz na aktywność mitochondriów komórkowych (test redukcji soli tetrazolowej MTT). Wskaźniki zaburzeń metabolizmu tlenowego w komórkach pod wpływem nanocząstek metali były: proces peroksydacji lipidów (test TBARS), całkowita zdolność oksydacyjna (test TOS) i antyoksydacyjna (test TAS) komórek oraz poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (test DCFH-DA). Ocenę oksydacyjnych uszkodzeń DNA w komórkach narażanych na nanocząstki tlenku cynku i srebra wykonano przez oznaczenie metodą kometową (SCGE w warunkach zasadowych) jednoniciowych pęknięć DNA (SSB) oraz oksydacyjnych uszkodzeń zasad rozpoznawanych przez glikozylazę formamido-pirymidynową (SSB-FPG).

Badane nanocząstki Ag oraz ZnO działały silnie cytotoksycznie, powodując zaburzenia funkcji mitochondriów i wzrost przepuszczalności błon komórkowych. Stwierdzono duże różnice pomiędzy działaniem cytotoksycznym metali w postaci nanoproszków a nanocząstkami metali
w stabilizowanych komercyjnie zawiesinach. Nanocząstki w zawiesinach działały silniej cytotoksycznie. Agregaty nanocząstek srebra i tlenków cynku wpływały na osłabienie ich cytotoksycznego działania.

Nanocząstki srebra oraz tlenków cynku powodowały zaburzenia metabolizmu tlenowego
w komórkach w postaci peroksydacji lipidów i nadprodukcji reaktywnych form tlenu

W wypadku Ag peroksydacja lipidów oraz powstawanie reaktywnych form tlenu (RFT)
w komórkach zachodziły w stężeniach mniejszych niż cytotoksyczne, przy czym zdolność do produkcji RFT oceniana na podstawie oznaczania poziomu TOS była znacznie większa niż całkowita zdolność antyoksydacyjna (TAS), co może wskazywać na powstawanie stresu oksydacyjnego w komórkach. Wyniki testu kometowego wykazały, że RFT powstające w komórkach pod wpływem nanocząstek srebra mogą powodować oksydacyjne uszkodzenia DNA.

Nanocząstki ZnO powodowały peroksydację lipidów w komórkach w stężeniach cytotoksycznych, natomiast wzrost całkowitego potencjału oksydacyjnego (TOS) w komórkach obserwowano w stężeniach poniżej wartości IC₅₀. Powstawaniu RFT w komórkach towarzyszył nieznaczny (w porównaniu z kontrolą) wzrost całkowitej zdolności antyoksydacyjnej komórek. Działanie prooksydacyjne tlenku cynku nie prowadziło jednak do oksydacyjnych uszkodzeń DNA rozpoznawanych przez FPG w teście kometowym.

Projekt I.B.01. Porównanie całkowitego poziomu oksydacyjnego w komórkach CHO-9 narażanych na badane nanocząstki srebra w stosunku do kontroli

Projekt I.B.01. Wpływ nanocząstek srebra na powstawanie jednoniciowych peknięć DNA (SSB)
i uszkodzeń oksydacyjnych DNA (SSB-FPG) w komórkach CHO-9 ocenianych testem kometowym na podstawie zawartości DNA w ogonie

Przeprowadzone badania wykazały, że określenie parametrów fizykochemicznych nanocząstek ma fundamentalne znaczenie w ocenie narażenia, gdyż właściwości fizyczne (rozkład wielkości cząstek, stopień agregacji) wpływają na siłę działania toksycznego nanomateriałów. Zdolność nanocząstek pyłów do tworzenia agregatów i aglomeratów wpływa na zmniejszenie ich biodostępności i toksyczności, może zatem być czynnikiem ograniczającym narażenie w środowisku pracy. Nanocząstki Ag lub ZnO w roztworach (zawiesinach), w razie ich uwalniania do powietrza środowiska pracy, np. w postaci aerozoli, mogą stanowić zagrożenie.

Wyniki badań ankietowych przeprowadzonych podczas seminariów organizowanych w ramach realizacji projektu wykazały, że wiedza dotycząca zagrożeń stwarzanych przez nanocząstki metali w środowisku pracy jest niewystarczająca. Nanomateriały nie są czynnikiem uwzględnianym w ocenie ryzyka zawodowego. Przedsięwzięcia edukacyjne i upowszechniające są szczególnie potrzebne środowiskom zawodowym zajmującym się ochroną człowieka w środowisku pracy (90% respondentów). W ramach realizacji projektu opracowano: broszurę informacyjną nt. zagrożeń wynikających z toksycznego działania nanocząstek metali oraz materiały szkoleniowe wraz z prezentacją multimedialną dotyczące oceny i ograniczania ryzyka zawodowego dla pracujących w narażeniu na nanocząstki metali/tlenków metali. Opracowano również zalecenia dotyczące oceny i ograniczania ryzyka zawodowego dla pracujących w narażeniu na nanocząstki metali/tlenków metali, przeznaczone do zamieszczenia w serwisie internetowym CIOP-PIB.

Wyniki badań zostały upowszechnione w formie 2 publikacji (oraz 1 publikacji będącej
w recenzji), referatów i doniesień na 7 konferencjach oraz 3 seminariach.

Zalecenia do oceny i ograniczania ryzyka zawodowego związanego z narażeniem na nanocząstki metali i tlenków metali Autor: Lidia Zapór, CIOP-PIB 2013 r.