Ocena metodami in vitro potencjalnych odległych efektów narażenia na wybrane nanomateriały ceramiczne

Celem projektu była ocena metodami in vitro potencjalnych odległych skutków narażenia na wybrane nanomateriały stosowane w ceramice technicznej.

W ramach projektu wytyczono i zrealizowano następujące cele szczegółowe:

• przeprowadzono ocenę cytotoksycznego działania nanometrycznego ditlenku cyrkonu, ditlenku ceru i haloizytu w warunkach krótko- i długotrwałego narażenia; oceniono zaburzenia metabolizmu tlenowego w komórkach pod wpływem narażenia na badane nanomateriały; zbadano wpływ nanomateriałów na stopień uszkodzeń materiału genetycznego (DNA) w komórkach oraz czy uszkodzenia DNA mogą być spowodowane przez reaktywne formy tlenu
• opracowano broszurę informacyjną nt. szkodliwości nanomateriałów ceramicznych i profilaktyki zagrożeń związanych z ich stosowaniem; przygotowano materiały szkoleniowe do oceny i ograniczania ryzyka zawodowego dla pracujących w narażeniu na nanomateriały ceramiczne oraz przeprowadzono seminarium weryfikujące opracowane produkty
• przygotowano publikacje upowszechniające wyniki realizacji projektu.

Badano nanomateriały tlenkowe: tlenek cyrkonu(IV) o nominalnej wielkości cząstek poniżej 100 nm i tlenek ceru(IV) o nominalnej wielkości cząstek poniżej 25 nm oraz haloizyt z grupy materiałów glinokrzemianowych o strukturze nanorurek. Badania prowadzono na komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych (A549), komórkach nabłonka oskrzelowego (BEAS-2B) oraz komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO-9) i komórkach kanalików nasiennych myszy (komórki Sertoliego, 15P-1).

Nanomateriały scharakteryzowano pod kątem rozkładu wielkości cząstek i stabilności stosowanych zawiesin zarówno w roztworach stosowanych do sporządzania roztworów wyjściowych, jak i w pożywkach do hodowli komórek, w tzw. „czasie rzeczywistym” doświadczenia za pomocą metody dynamicznego rozpraszania światła (metoda DLS) oraz analizy śledzenia nanocząstek (metoda NTA). Przeprowadzono analizę morfologiczną pyłów za pomocą skaningowego obrazowania mikroskopowego (SEM) oraz oznaczono pole powierzchni właściwej metodą BET.

Działanie cytotoksyczne nanomateriałów oceniano po 24 oraz 72 h narażania komórek na podstawie testów określających integralność błon komórkowych (test NRU) i aktywność metaboliczną komórek (testy redukcji soli tetrazolowych MTT i WST-1) oraz oznaczania kwasów nukleinowych (test DAPI/AO). Do oceny następstw toksycznego działania badanych nanomateriałów po długotrwałym (7-10 dni) narażaniu komórek zastosowano test wydajności tworzenia kolonii (test klonogenny, CFEA) oceniający zdolność komórek do procesów odnowy i prawidłowego namnażania się (tworzenia kolonii). Jako wskaźniki zaburzeń metabolizmu tlenowego w komórkach oceniano całkowitą zdolność oksydacyjną (test TOS) i antyoksydacyjną (test TAS) komórek. Ocenę uszkodzeń DNA w komórkach wykonano na podstawie oznaczania metodą kometową (SCGE w warunkach zasadowych) jednoniciowych pęknięć DNA (SSB) oraz oksydacyjnych uszkodzeń zasad rozpoznawanych przez glikozylazę formamido-pirymidynową (SSB-FPG).

Badane nanomateriały ceramiczne wykazywały działanie toksyczne w różnym zakresie stężeń, zależnie od rodzaju komórek stosowanych do oceny i czasu ich narażenia. Najbardziej czułym modelem badawczym były komórki A549 i CHO-9.

Nanometryczny tlenek cyrkonu(IV) wykazywał słabe działanie cytotoksyczne na wszystkie komórki, które zwiększało się z czasem narażenia, natomiast prooksydacyjnie działał głównie na komórki A549 i CHO (rys. 1). Wzrost całkowitego potencjału oksydacyjnego (TOS) w tych komórkach obserwowano w stężeniach poniżej wartości IC₅₀, co sugeruje, że toksyczność ZrO₂ może być spowodowana przez wzrost stężenia reaktywnych form tlenu i narastający stres oksydacyjny. W wysokich stężeniach powodował szkodzenia DNA (w komórkach BEAS-2B i CHO-9), które nie były związane z uszkodzeniami oksydacyjnymi (test kometowy).

Haloizyt działał cytotoksycznie w niskich stężeniach (zwłaszcza na komórki CHO-9, A549). W większości przypadków nie powodował uszkodzeń DNA. W stężeniach wyższych niż cytotoksyczne obserwowano równoczesny wzrost potencjałów TOS/TAS, co może sugerować, że wysoka cytotoksyczność nie jest spowodowana stresem oksydacyjnym.

Nanometryczny tlenek ceru(IV) wykazywał działanie cytotoksyczne wzrastające z czasem narażenia. Powodował działanie oksydacyjne w stężeniach cytotoksycznych, któremu towarzyszyło silne działanie antyoksydacyjne. W stężeniach cytotoksycznych powodował uszkodzenia DNA. W przypadku komórek CHO uszkodzenia DNA miały charakter oksydacyjny.

Pomimo rozbieżności danych uzyskiwanych na różnych modelach badawczych, ostateczne wyniki wskazują na potencjalne zagrożenie związane ze stosowaniem badanych nanomateriałów i uzasadniają podjęcie działań zmierzających do oceny i ograniczenia ryzyka związanego z narażeniem na te substancje na stanowiskach pracy.

Projekt II.P.01.Porównanie całkowitego potencjału oksydacyjnego (TOS) i antyoksydacyjnego (TAS) w komórkach układu oddechowego A549 narażanych na nanometryczny ditlenek cyrkonu

W ramach realizacji projektu opracowano broszurę informacyjną pt. „Nanotechnologie  w przemyśle ceramicznym. Potencjalne zagrożenia. Zasady bezpiecznej pracy” oraz materiały szkoleniowe pt. „Zalecenia do oceny i ograniczania ryzyka zawodowego dla pracujących w narażeniu na nanomateriały ceramiczne” zawierające część teoretyczną i prezentację multimedialną oraz przeprowadzono seminarium weryfikujące opracowane produkty pod kątem ich przydatności w kształtowaniu bezpiecznych warunków pracy.

Wyniki realizacji projektu zostały upowszechnione w formie 6 publikacji (oraz dwóch manuskryptów przygotowanych do publikacji), a także referatów i doniesień na 6 konferencjach  i dwóch seminariach.

Nanotechnologie w przemyśle ceramicznym – potencjalne zagrożenia, zasady bezpiecznej pracy Autorzy: dr Lidia Zapór, dr Jolanta Skowroń, dr Katarzyna Miranowicz-Dzierżawska 2016 r.