Ocena odpowiedzi prozapalnej w ludzkich komórkach układu oddechowego pod wpływem wybranych nanomateriałów stosowanych w suchych środkach smarnych

Celemprojektubyła ocena odpowiedzi prozapalnej w ludzkich komórkach układu oddechowego pod wpływem wybranych nanomateriałów stosowanych w suchych środkach smarowych.

Cel ten był realizowany poprzez ocenę cytotoksycznych uszkodzeń w modelowych komórkach układu oddechowego po krótkotrwałym i przedłużonym narażeniu na wybrane nanomateriały oraz ocenę nasilenia uwalniania mediatorów reakcji zapalnych w komórkach pod wpływem narażenia.

Badania prowadzono na prawidłowych komórkach ludzkiego nabłonka oskrzelowego (BEAS-2B), komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych pochodzenia nowotworowego (A549) odpowiadających morfologicznie pneumocytom II rzędu oraz komórkach monocytoidalnych (THP-1), które różnicowano do makrofagów.

Oceniano działanie nanometrycznych siarczków molibdenu, wolframu i tlenku molibdenu w postaci pyłów oraz disiarczki molibdenu w stabilizowanych zawiesinach, różniące się kształtem i wielkością cząstek: nanometryczny disiarczek molibdenu (n-MoS₂) składający się z jednorodnych cząstek w kształcie dysków o średnicy < 100 nm oraz mikrometryczny (m-MoS₂) o strukturze heksagonalnych wielowarstwowych płytek o średnicy cząstek > 1 µm.

W badaniu cytotoksycznego działania związków, ocenianego na podstawie testów określających integralność błon komórkowych oraz aktywność metaboliczną komórek po 24, 48 i 72 h narażania, dowiedziono, że siarczki molibdenu i wolframu wykazywały podobne, słabe działanie cytotoksyczne na komórki układu oddechowego, które w niewielkim stopniu nasilało się z czasem narażenia. Najsilniejsze działanie cytotoksyczne w pełnym zakresie stosowanych stężeń i zależnie od czasu narażenia wykazywał tritlenek molibdenu.

Z kolei ocena zdolności komórek do procesów odnowy i prawidłowego namnażania się (proliferacji) po przedłużonym do 9 dni czasie narażania na badane nanomateriały przeprowadzona na podstawie testu wydajności tworzenia kolonii (test klonogenny) wykazała działanie cytotoksyczne wszystkich związków w niskim zakresie stężeń (25 µg/ml), co wskazuje na możliwe odległe skutki narażenia.

Do oceny reakcji prozapalnych zachodzących w komórkach układu oddechowego pod wpływem narażenia na badane nanomateriały wybrano cytokiny z grupy interleukin: IL-1 β, IL-6, IL-8 oraz czynnik martwiczy nowotworu (TNF-α), uznane za wiodące w inicjowaniu reakcji zapalnych w płucach osób narażonych na działanie pyłów ultradrobnych. Do oceny indukcji prozapalnych cytokin zastosowano metodę immunoenzymatyczną (test ELISA podwójnego wiązania) umożliwiającą pomiar stężeń uwalnianych przez komórki cytokin oraz technikę tzw. reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym(RT-PCR) oceniającą względny (w stosunku do genu referencyjnego) poziom mRNA specyficznego dla badanych cytokin.

Narażenie komórek układu oddechowego zarówno na n-MoS₂, jaki im-MoS₂ powodowało nasilenie uwalniania wszystkich oznaczanych cytokin w stosunku do komórek nienarażanych. Poziom uwalnianych cytokin różnił się w zależności od rodzaju badanych komórek, czasu ich narażania i stosowanej metody badawczej.

Oznaczanie stężeń białek cytokin (test ELISA) wskazywało na silniejsze prozapalne działanie n‑MoS₂ w porównaniu z m‑MoS₂, co jednak nie zostało jednoznacznie potwierdzone w badaniachcytokinowego mRNA.

Projekt  II.N.11.A. Porównanie stężeń cytokiny IL-6 (wartości wyrażone jako % kontroli) w komórkach BEAS-2B, THP-1 oraz A549 narażanych na n-MoS₂ lub m-MoS₂ oznaczanych testem ELISA

Projekt  II.N.11.A. Porównanie poziomu mRNA specyficznego dla cytokiny IL-6 (wartości wyrażone jako % kontroli) w komórkach BEAS-2B, THP-1 oraz A549 narażanych na n-MoS₂ lub m-MoS₂ oznaczanego metodą RT-PCR.

Najbardziej skuteczne w ocenie reakcji prozapalnych w badanych komórkach po narażeniu na oba MoS₂ były interleukiny IL-6 oraz TNF-α. Oba związki powodowały w komórkach zwiększoną sekrecję tych cytokin zarówno na poziomie białka, jak i mRNA.

W przypadku wszystkich badanych substancji obserwowano zależność uzyskiwanych skutków toksycznych od rodzaju narażanych komórek. Najbardziej czułym modelem badawczym były komórki BEAS-2B, pełniące na poziomie organizmu rodzaj bariery dla ksenobiotyków. Obserwowane w badaniach zahamowanie zdolności komórek BEAS-2B do proliferacji oraz wzmożona indukcja prozapalnych cytokin wpływem badanych nanomateriałów może świadczyć o niekorzystnych odległych skutkach narażenia na badane nanomateriały.

Wyniki badań doświadczalnych wskazują na potencjalne zagrożenie związane ze stosowaniem nanomateriałów w środkach smarowych oraz zasadność uwzględniania ich w ocenie ryzyka zawodowego i podejmowania działań do jego ograniczenia.

Zrealizowano również działania na rzecz zwiększania świadomości zagrożeń związanych ze stosowaniem nanomateriałów w środkach smarowych poprzez opracowanie broszury nt. szkodliwości nanomateriałów w suchych środkach smarowych i profilaktyki zagrożeń związanych z ich stosowaniem oraz zaleceń do oceny i ograniczania ryzyka zawodowego. Badania ankietowe przeprowadzone podczas seminarium weryfikującego opracowane produkty wykazały, że przedsięwzięcia edukacyjne i upowszechniające są szczególnie potrzebne środowiskom zawodowym zajmującym się ochroną człowieka w środowisku pracy (ok. 60% respondentów).

Wyniki projektu przedstawiono w 2 publikacjach w czasopismach o zasięgu międzynarodowym, 1 publikacji w czasopiśmie o zasięgu krajowym i 2 publikacjach przygotowanych do czasopism o zasięgu międzynarodowym oraz zaprezentowano w referatach i doniesieniach na 3 konferencjach międzynarodowych, 4 konferencjach krajowych i 1 seminarium.