Badanie źródeł i dróg rozprzestrzeniania się szkodliwych czynników mikrobiologicznych w środowisku pracy z wykorzystaniem metod biochemicznych i profilowania genetycznego

W dostępnym piśmiennictwie przedmiotu zauważalny jest brak kompleksowego podejścia do jakościowej i ilościowej ewaluacji zanieczyszczenia mikrobiologicznego środowiska pracy oraz badań porównujących pokrewieństwo mikroorganizmów wyizolowanych z próbek skażonych materiałów występujących w danym zakładzie pracy z izolowanymi mikroorganizmami ze strefy oddechowej pracownika (próbki bioaerozolu). Stąd też, celem nadrzędnym projektu było opracowanie metodyki identyfikacji szkodliwych czynników mikrobiologicznych w środowiskach pracy o różnym stopniu mikrobiologicznego zanieczyszczenia.

W celu zbadania dróg rozprzestrzeniania się szkodliwych czynników mikrobiologicznych  w zakładach pracy związanych z przetwarzaniem biosurowców pochodzenia roślinnego i zwierzęcego do celów energetycznych (elektrownie) pobierano próbki bioaerozolu, biosurowców oraz od pracowników wymazy z rąk i zużyte półmaski ochronne. W zebranych próbkach określano stężenie bakterii i grzybów, a wyizolowane mikroorganizmy identyfikowano za pomocą metod hodowlanych oraz testów biochemicznych API. Wytypowane mikroorganizmy wiodące zostały następnie poddane analizie genotypowej metodą RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA – Polymerase Chain Reaction) z wykorzystaniem zoptymalizowanych profili temperaturowo-czasowych. Produkty reakcji rozdzielano za pomocą elektroforezy pionowej w żelu poliakrylamidowym. Podobieństwo genetyczne przedstawiano w postaci dendrogramów utworzonych z wykorzystaniem metody klasteryzacji UPGMA (Unweighted Pair Group Method With Arthmetic Mean) i współczynnika korelacji Pearsona.

Charakter pracy towarzyszący przetwarzaniu biosurowców do celów energetycznych wiąże się z długotrwałym przebywaniem pracowników w mocno zanieczyszczonym mikrobiologicznie środowisku. Na stanowiskach pracy w elektrowniach średnie stężenia aerozolu bakteryjnego  i grzybowego kształtowały się na poziomie 9,9×10⁵ jtk/m³ i 9,8×10⁵ jtk/m³ i przekraczały dopuszczalne stężenia proponowane dla pomieszczeń roboczych zanieczyszczonych pyłem organicznym. Średnie stężenia mikroorganizmów bakteryjnych i grzybowych w badanych próbkach biomasy, półmasek ochronnych oraz wymazów z rąk wynosiły odpowiednio 1×10⁶ jtk/g  i 2×10⁴ jtk/g; 1,9×10³ jtk/cm² i 1,4×10³ jtk/cm² oraz 1,4×10⁴ jtk/ml i 1,2×10³ jtk/ml.

We wszystkich rodzajach próbek dominującą grupą mikroorganizmów były grzyby pleśniowe z rodzaju Aspergillus, w tym chorobotwórczy grzyb A. fumigatus. Wśród najczęściej izolowanych drobnoustrojów bakteryjnych znajdowały się gatunki z rodzaju Bacillus: B. licheniformis, B. pumilus i B. subtilis; z rodzaju Staphylococcus – S xylosus. Zastosowanie w niniejszym projekcie metody typowania genetycznego RAPD-PCR umożliwiło identyfikację dróg rozprzestrzenia się drobnoustrojów oraz ich źródeł w analizowanym środowisku pracy. Analiza uzyskanych profili elektroforetycznych szczepów bakterii z rodzajów Bacillus i Staphylococcus wskazuje, że główną drogą rozprzestrzenia się tych bakterii jest bezpośredni kontakt z biosurowcami. Główną drogą rozprzestrzenia się grzybów Aspergillus fumigatus jest droga powietrzno-pyłowa oraz kontakt bezpośredni z biosurowcami. Metoda RAPD-PCR może stanowić relatywnie szybki i łatwy sposób monitorowania wewnątrzgatunkowej zmienności genetycznej patogenów na stanowiskach pracy.

Zaprezentowane wyniki wzbogacają wiedzę na temat różnorodności genetycznej i biochemicznej mikroorganizmów w środowisku pracy związanym z przetwarzaniem biosurowców pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Uwidocznione za pomocą metody RAPD-PCR bliskie pokrewieństwo (80-93,5%) między izolatami pochodzącymi od pracowników i próbek środowiskowych może wskazywać na potrzebę wprowadzenia szerszych działań profilaktycznych  w celu ograniczenia narażenia na bakteryjne czynniki biologiczne związane z przetwórstwem biomasy.

Projekt II.P.16: A – przykładowe stanowisko pracy: rozładunek biosurowców; B – przykładowy dendrogram podobieństwa genetycznego szczepów B. licheniformis (szczepy izolowano z: M – masek ochronnych, W – rąk pracowników, B – biosurowców)

Na podstawie wyników badań opracowano broszurę zawierającą zalecenia do metodyki oznaczania szkodliwych czynników mikrobiologicznych. Opracowany materiał zawiera: a) zalecenia dotyczące wyboru stanowisk pomiarowych, rodzaju próbek oraz wyboru metody pomiaru i analizy; b) instrukcje pomiarowe bioaerozlu, biosurowców, wymazów z powierzchni użytkowych i rąk pracowników oraz półmasek ochronnych; c) protokoły analizy mikrobiologicznej ww. próbek z użyciem metod biochemicznych i profilowania genetycznego (RAPD-PCR);  d) informacje dotyczące interpretacji uzyskanych wyników. Opracowano również w formie broszury zalecenia do oceny i ograniczania ryzyka zawodowego powodowanego przez szkodliwe czynniki biologiczne w zakładach produkujących i przetwarzających biosurowce. Przygotowano także materiały szkoleniowe oraz materiały informacyjne do wprowadzenia do bazy BioInfo  w serwisie internetowym CIOP-PIB (około 5 tys. wejść/rok). Opracowane broszury i materiały będą stanowić niezbędne wsparcie merytoryczne dla osób zainteresowanych przeprowadzeniem pomiarów mikrobiologicznych, wykonaniem oceny ryzyka zawodowego oraz doborem środków profilaktycznych w zakładach pracy. Przewiduje się przekazanie broszur do zakładów produkujących i przetwarzających biosurowce do celów energetycznych, do zainteresowanych laboratoriów diagnostycznych, w tym Państwowej Inspekcji Sanitarnej, Głównego Inspektoratu Sanitarnego, Wojewódzkich Stacji Sanitarno-Epidemiologicznych, a także specjalistów ds. BHP. W celu weryfikacji ww. zaleceń i materiałów przeprowadzono 2 seminaria.

Wyniki uzyskane w ramach niniejszego projektu zaprezentowano na 4 międzynarodowych konferencjach naukowych, przygotowano 3 manusrypty publikacji.